本試驗(yàn)采用高效液相色譜-示差折光(HPLC-RID)和高效液相色譜-熒光(HPLC-FLD)法，研究建立混合型飼料添加劑中豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量的高效液相色譜測(cè)定方法，并對(duì)2種高效液相色譜法、重量法、容量法膽汁酸含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較分析。HPLC-RID法：試樣用甲醇-乙腈-水溶液提取，C18柱分離，HPLC-RID測(cè)定，3種膽汁酸的定量限為10.0-20.0mg/g,平均回收率為82.54%-108.50%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.90%-7.61%；HPLC-FLD法：試樣用甲醇提取，氫氧化鉀甲醇溶液皂化，以1,4,7,10,13,16-六氧雜環(huán)十八烷乙腈液和4-溴甲基-7-甲氧基香豆素乙腈液衍生，C18柱分離，HPLC-FLD測(cè)定，3種膽汁酸的定量限為2.0-3.0mg/g，平均回收率為70.43%-84.31%，RSD為4.82%-9.80%。結(jié)果表明：HPLC-RID法、HPLC-FLD法均可測(cè)定混合型飼料添加劑中的3種膽汁酸含量，但由于HPLC-FLD法膽汁酸需要衍生，易受樣品基質(zhì)影響，膽汁酸含量測(cè)定結(jié)果重現(xiàn)性、穩(wěn)定性差；重量法、容量法測(cè)定的是混合型飼料添加劑中所有膽汁酸的總含量，但由于方法特性所限，容量法測(cè)定結(jié)果不能準(zhǔn)確反映產(chǎn)品所有膽汁酸的總含量。本研究建立的HPLC-RID法重現(xiàn)性、穩(wěn)定性、可信度高，適用于混合型飼料添加劑中豬膽酸、豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸含量的測(cè)定；重量法適用于混合型飼料添加劑中膽汁酸總含量的測(cè)定。

目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道有關(guān)膽汁酸含量測(cè)定方法主要有薄層色譜法、分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法。薄層色譜法需要復(fù)雜的純化前處理，其結(jié)果易受試驗(yàn)條件影響；分光光度法操作簡(jiǎn)單，但無法準(zhǔn)確定量測(cè)定3種膽汁酸含量；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法需要進(jìn)行復(fù)雜的衍生處理，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法樣品需要凈化處理，靈敏度均特別高，不適合含量較高的飼料添加劑膽汁酸定量分析；高效液相色譜法樣品前處理簡(jiǎn)單，線性范圍、靈敏度等更適合混合型飼料添加劑膽汁酸主成分含量檢測(cè)。本試驗(yàn)研究建立混合型飼料添加劑中3種膽汁酸含量的高效液相色譜-示差折光( HPLC-RID)法、高效液相色譜-熒光( HPLC-FLD)法，并與現(xiàn)有的重量法、容量法進(jìn)行對(duì)比，明確4種方法的測(cè)定原理、測(cè)定對(duì)象、測(cè)定結(jié)果的差異，旨在為飼料和飼料添加劑生產(chǎn)企業(yè)選擇適宜的混合型飼料添加劑中膽汁酸含量檢測(cè)方法、加強(qiáng)混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品質(zhì)量控制及其科學(xué)規(guī)范使用提供技術(shù)支撐。

HPLC-FLD和HPLC-RID方法比較

采用HPLC-FLD和HPLC-RID２種方法測(cè)定樣品中３種膽汁酸含量測(cè)定結(jié)果（見表1），HPLC-RID法均較HPLC-FLD法高，這可能是由于HPLC-FLD法前處理較復(fù)雜，需要皂化、衍生后進(jìn)行HPLC測(cè)定，皂化、衍生過程易產(chǎn)生損失，方法回收率、重復(fù)性均較HPLC-RID法低，使其最終總含量略低于HPLC-RID法。經(jīng)過多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HPLC-RID法和HPLC-FLD法檢測(cè)３種膽汁酸的定量限相差數(shù)倍，這是基于檢測(cè)器本身引起的差異，示差折光檢測(cè)器的檢測(cè)基于被分析物的折光指數(shù)的差異，即測(cè)量樣品流路與參比流路在折光指數(shù)上的差別，其靈敏度較低、選擇性較差，對(duì)流速、溫度及黏度的變化敏感；而熒光檢測(cè)器是一種高靈敏的選擇性檢測(cè)器，它適用于檢測(cè)物質(zhì)本身具有熒光或?yàn)榱颂岣哽`敏度將沒有熒光的物質(zhì)衍生成熒光衍生物；由于飼料添加劑膽汁酸含量較高，HPLC-RID的檢出限、線性范圍均可以滿足混合型飼料添加劑膽汁酸主成分含量的檢測(cè)需要。另外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HPLC-FLD法容易受混合型飼料添加劑載體影響，因?yàn)榛旌闲惋暳咸砑觿┠懼岙a(chǎn)品大多會(huì)使用麥飯石、糠、淀粉等作為載體，每家生產(chǎn)企業(yè)配方可能不一樣，HPLC-FLD法衍生過程中易受載體基質(zhì)等影響，造成膽汁酸衍生反應(yīng)不穩(wěn)定、衍生效果不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致３種膽汁酸響應(yīng)值不穩(wěn)定，特別容易引起批間測(cè)定結(jié)果差別大，方法重復(fù)性和再現(xiàn)性差；HPLC-RID法前處理非常簡(jiǎn)單，僅需要用流動(dòng)相提取后直接進(jìn)行HPLC分析，方法穩(wěn)定性好，非常適合混合型飼料添加劑中的豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量的測(cè)定。

HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法和容量法之間的比較

采用HPLC-RID法、HPLC-FLD法、重量法和容量法對(duì)混合型飼料添加劑膽汁酸樣品進(jìn)行膽汁酸總含量的測(cè)定（見表2），容量法膽汁酸總含量測(cè)定結(jié)果最高，重量法次之，而HPLC-FLD法、HPLC-RID法相對(duì)偏低。這主要是因?yàn)椋捶N方法的原理不同，重量法用乙醇-氫氧化鈉水解試樣、乙醚提取所有膽汁酸，回收乙醚后干燥，重量法得到混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品的總膽汁酸含量，因各混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品原料來源不一，生產(chǎn)工藝差異大，混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品除含有《飼料添加劑品種目錄》規(guī)定的豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸外，還可能含有膽酸、去氧膽酸、石膽酸等10多種膽汁酸；而容量法用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，滴定過程會(huì)中和混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中所有無機(jī)酸和有機(jī)酸，含量最高；HPLC-RID法、HPLC-FLD法可對(duì)豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸等３種膽汁酸進(jìn)行準(zhǔn)確定性定量分析，僅測(cè)定這３種膽汁酸的總含量。混合型飼料添加劑膽汁酸生產(chǎn)企業(yè)、飼料企業(yè)可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)室條件和檢測(cè)需要選擇適宜的膽汁酸含量測(cè)定方法。

1.若針對(duì)混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸的含量進(jìn)行檢測(cè)，HPLC-RID法、HPLC-FLD法均可準(zhǔn)確測(cè)定。但HPLC-FLD法測(cè)定結(jié)果重復(fù)性和再現(xiàn)性差，建議選擇前處理更簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好的HPLC-RID測(cè)定混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量。

2.若針對(duì)混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中的所有膽汁酸的總含量檢測(cè)，由于容量法滴定中和產(chǎn)品中所有的無機(jī)酸和有機(jī)酸，測(cè)定結(jié)果不能正確反映產(chǎn)品中所有膽汁酸的總含量，建議采用《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版一部)》規(guī)定的重量法(豬膽粉法)測(cè)定混合型飼料添加劑膽汁酸產(chǎn)品中的膽汁酸總含量。

原文：聶倩倩,王鑫,楊發(fā)樹,等.混合型飼料添加劑中膽汁酸含量測(cè)定方法比較研究[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2024,36(03):1942-1951.

作者:聶倩倩,王鑫,楊發(fā)樹,等

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