摘要

青島柯能集團(tuán)聯(lián)合黃海水產(chǎn)研究所、中國海洋大學(xué)共同完成的一項(xiàng)研究，闡明了溶血卵磷脂（LPC）對攝入高脂飼料的大菱鲆幼魚腸道健康的調(diào)控作用及機(jī)制，該研究發(fā)表于國際知名期刊《Nutrients》。

本實(shí)驗(yàn)在高脂（16%）基礎(chǔ)飼料中分別添加0%、0.1%、0.25%及0.5%的溶血卵磷脂（LPC0、LPC0.1、LPC0.25、LPC0.5），進(jìn)行為期8周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果顯示：在添加LPC的處理組中，腸道組織形態(tài)觀察中沒有出現(xiàn)固有層變寬和炎性細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象。添加LPC明顯降低了TLRs（TLR3、TLR8、TLR9和TLR22）、MyD88和信號分子（NF-κB、JNK和AP-1）的基因表達(dá)。同樣，不同水平LPC的添加也明顯抑制了NF-κB和JNK信號通路下游因子（TNF-α、IL-1β、Bax、Caspase9和Caspase-3）的基因表達(dá)。這些基因表達(dá)結(jié)果表明了LPC對腸道粘膜屏障功能的改善作用。此外，高脂飼料中添加LPC也改變了腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)，上調(diào)了短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌、乳酸菌和消化相關(guān)菌的相對豐度。腸道微生物的功能預(yù)測結(jié)果表明，與對照組相比，飼料中添加了LPC的大菱鲆幼魚在脂質(zhì)代謝和免疫系統(tǒng)等通路上的相對豐度更高，而在代謝性疾病和免疫系統(tǒng)疾病等通路的富集程度相對更低。總之，LPC可以通過TLR信號途徑調(diào)控大菱鲆腸道粘膜免疫和機(jī)械屏障功能，并且改善了腸道微生物的組成和功能。

（原文標(biāo)題：Effects of lysophosphatidylcholine on intestinal health of turbot fed high-lipid diets）

主要發(fā)現(xiàn)：

1）LPC顯著改善了大菱鲆腸道組織損傷

如圖1E,F所示，在LPC0組的后腸中觀察到混合白細(xì)胞的浸潤，固有層增寬，以及排列混亂的微絨毛，但在添加LPC的處理組中未觀察到這些癥狀。與LPC0組相比，添加了LPC的3個處理組的腸道粘膜皺褶高度（hMF）和粘膜肌層厚度（hMM）顯著增加，而微絨毛高度（hMV）和周長比（PR）僅分別在LPC0.1和LPC0.5組發(fā)生明顯增加（P < 0.05）（圖2）。

圖1 各組后腸組織形態(tài)觀察

（A）、（B）、（C）、（D）的比例尺 = 500 μm，（E）、（F）、（G）、（H）的比例尺 = 50 μm。染色：蘇木精伊紅染色H&E。紅星顯示混合白細(xì)胞浸潤在固有層（LP）中。MF：黏膜褶皺；MM：肌層粘膜；MV：微絨毛（黑色箭頭）。

圖2 腸道組織學(xué)測量參數(shù)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同的上標(biāo)字母表示顯著差異（p < 0.05）。MF：黏膜褶皺；MM：肌層粘膜；MV：微絨毛；PR：周長比。

2）腸道屏障基因表達(dá)表明LPC改善了腸道粘膜屏障功能

飼料中添加0.1-0.5%LPC顯著降低了TLR3、TLR8、TLR9和TLR22的基因表達(dá)水平（P < 0.05）（圖3A）；LPC的添加顯著下調(diào)了髓樣分化蛋白88（MyD88）和TLR信號通路的下游調(diào)節(jié)分子，如IRF3、NF-κB、JNK和AP-1的基因表達(dá)水平（P < 0.05）（圖3B）；飼料中添加LPC顯著下調(diào)IL-1β和TNF-α的基因表達(dá)，而0.1%和0.25%的LPC可明顯下調(diào)IFN-γ的表達(dá)（P < 0.05）（圖3C）；飼料中添加LPC顯著下調(diào)了促凋亡分子，包括Bax、Caspase-9和Caspase-3的基因表達(dá)水平（P < 0.05）。與LPC0組相比，添加0.1%和0.25%LPC的處理組中，PCNA的基因表達(dá)水平明顯上調(diào)（P >0.05）（圖3D）。

圖3 溶血卵磷脂對大菱鲆后腸TLR信號通路和腸粘膜屏障相關(guān)因子的基因表達(dá)的影響

（A-B）Toll 樣受體（TLR）、銜接蛋白和下游調(diào)節(jié)分子;（C）炎性細(xì)胞因子;（D）上皮細(xì)胞凋亡與增殖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤，不同的字母表示顯著性差異（P < 0.05）

3）LPC改變了腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)

每組四個樣品共16個樣品的基因組DNA經(jīng)過組裝、質(zhì)量控制和拼接，共獲得1,008,526個高質(zhì)量的有效標(biāo)簽，聚類為12,240個OTU，序列相似度超過97%。稀疏曲線和物種積累圖結(jié)果顯示，所有樣品能滿足測序深度（圖4A，B）。文氏圖顯示，所有組別共有1228個OTUs，LPC0、LPC0.1、LPC0.25和LPC0.5組別中的獨(dú)特OTU數(shù)量分別為584、906、1290和1534（圖4C）。

門水平上，Proteobacteria和Firmicutes為優(yōu)勢菌門，且在所有組別中，Bacteroidetes的相對豐度僅次于它們。屬水平上，前10優(yōu)勢菌屬包括Mycoplasms、Ralstonia、Bacteroides、Prevotella、Fusobacterium、Alteromonas、Escherichia-Shigella、Alistipes、Faecalibacterium和Parvimonas（圖4D、E）。與對照組相比，添加LPC的處理組中的Firmicutes與Bacteroidetes（F/B）的比例更低（P >0.05）（圖4F）。α-多樣性分析的結(jié)果顯示，添加0.25%和0.5%LPC的飼料顯著提高了大菱鲆腸道菌群的豐富度（observed species、Chao1和Ace）（P < 0.05）。飼料中添加0.1%LPC雖也上調(diào)了豐富度指數(shù)，但與對照組相比沒有顯著性差異（p > 0.05）。此外，在LPC0.25組中觀察到Shannon指數(shù)顯著增加（P < 0.05）（圖5）。

AMOVA檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，補(bǔ)充LPC組的腸道微生物群落概況與LPC組有明顯不同（分別為P = 0.026、0.006和0.028）。同樣，PCoA圖、NMDS圖和UPGMA的結(jié)果顯示，添加LPC的處理組的大菱鲆腸道細(xì)菌組成與LPC0組之間有明顯的區(qū)別（圖6）。

圖4 不同分類水平上的相對豐度圖

（A）稀釋曲線;（B）物種積累箱線圖;（C）Veen圖;（D-E）門和屬水平的Top10;（F）厚壁菌門/擬桿菌門的比值。

圖5  實(shí)驗(yàn)大菱鲆腸道微生物群的α多樣性

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤，不同的字母表示顯著性差異（P < 0.05）。

圖6 實(shí)驗(yàn)大菱鲆腸道微生物群的β多樣性(PCoA圖, NMDS圖, AMOVA檢驗(yàn)）

4）LPC上調(diào)了多種潛在有益菌的相對豐度

對腸道菌群進(jìn)行了MetaStat分析，以比較所有組間屬和種水平的腸道細(xì)菌的相對豐度。在補(bǔ)充LPC的組中，一些潛在的有益細(xì)菌的相對豐度，如Faecalibacterium, Pseudomonas, Blautia, Bacillus, Lactobacillus, Ligilactobacillus, Pseudoalteromonas, Parasutterella, Bifidobacterium等，都顯著增加（P < 0.05）（圖7A-C）。種水平上，飼料中添加LPC明顯增加了Faecalibacterium prausnitzii、Bacillus velezensis、Lactobacillus murinus、Lactobacillus lindneri、Anaerostipes hadrus、Roseburia inulinivorans、Weissella cibaria、Lactobacillus plantarum、Phascolarctobacterium faecium等的相對豐度（P < 0.05）（圖7D，E）。

圖7不同分類水平上各組間實(shí)驗(yàn)大菱鲆后腸的metastat分析

（A-C）屬水平腸道微生物群中的潛在有益細(xì)菌：（A）短鏈脂肪酸生產(chǎn)者、（B）乳酸生產(chǎn)者、（C）消化酶產(chǎn)生細(xì)菌；（D-E）種水平上腸道微生物群中的潛在有益細(xì)菌：（D）短鏈脂肪酸生產(chǎn)者、（E） 乳酸生產(chǎn)者。*表示T檢驗(yàn)結(jié)果顯示LPC0組與LPC0.1，LPC0.25或LPC0.5組之間的存在顯著差異（*P < 0.05，**P < 0.01，*** P < 0.001）

5）LPC在脂質(zhì)代謝和免疫系統(tǒng)等通路上的相對豐度更高，而在代謝性疾病和免疫系統(tǒng)疾病等通路的富集程度相對更低

根據(jù)PICRUSt預(yù)測的KEGG orthologies（KOs），熱圖結(jié)果顯示，LPC處理組的腸道微生物在功能上與LPC0組有所不同（圖8）。level 2中，與對照組相比，添加LPC的處理組中，能量代謝、脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞運(yùn)動、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)和信號分子，以及相互作用等代謝通路富集，而核苷酸代謝、復(fù)制和修復(fù)、代謝性疾病、翻譯和免疫系統(tǒng)疾病等代謝通路豐度有所降低。Level3中，與對照組相比，參與氧化磷酸化、丁酸鹽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、甲烷代謝以及丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝的基因在添加LPC的處理組中表達(dá)相對更豐富。然而，與LPC0組相比，DNA復(fù)制蛋白、核糖體、氨基酸tRNA生物合成、糖酵解/葡萄糖生成、氨基酸相關(guān)酶、嘧啶代謝和嘌呤代謝等功能的相對豐度在LPC處理組中降低。

圖8 基于level 2（A）和level 3（B）KEGGs的功能預(yù)測結(jié)果

結(jié)論

1） 飼料中添加0.1-0.25%LPC對攝入高脂飼料的大菱鲆腸道健康有一定的保護(hù)作用。

2） LPC可以通過TLR介導(dǎo)的NF-κB途徑參與調(diào)節(jié)大菱鲆腸道的免疫，以及TLR介導(dǎo)的JNK和p38信號途徑調(diào)節(jié)機(jī)械屏障。

3） 大菱鲆腸道微生物對飼料中添加LPC 積極響應(yīng)，對腸道菌群的結(jié)構(gòu)和組成具有正向的改善作用。